Antialérgico 37

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dx. doi. org/10.1590/S0100-879X2007000100014 Braz J Med Biol Res, enero de 2007, Volumen 40 (1) 105-115 Estudio farmacológico de la actividad anti-alérgica de Syzygium cumini (L.) Skeels F. A. Brito 1. L. A. Lima 2. M. F.S. 3. M. J. Ramos Nakamura 2. C. S. Cavalher-Machado 1. A. C. Siani 2. M. G.M. O. Henriques 1 y A. L.F. Sampaio 1 1 Departamento de Farmacología Aplicada, Departamento de 2 Qucia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Río de Janeiro, RJ, Brasil Myrtaceae es una familia de plantas ampliamente utilizado en la medicina popular y Syzygium y Eugenia son algunos de los géneros más importantes. Se investigaron las propiedades antialérgicas de un extracto de hoja acuosa de Syzygium cumini (L.) Skeels (SC). El análisis por HPLC reveló que los taninos hidrolizables y flavonoides son los principales componentes del extracto. La administración oral de SC (25-100 mg / kg) en ratones suizos (20-25 g; N = 7 / grupo) edema de la pata inhibido inducida por compuesto 48/80 (50% de inhibición, 100 mg / kg; P 8,4 ng / ml) en el lavado pleural, mediante ELISA. Estos hallazgos demuestran un efecto anti-alérgica de SC, e indican que su efecto anti-edematogenic se debe a la inhibición de la desgranulación de los mastocitos y de histamina y serotonina efectos, mientras que la inhibición de la acumulación de eosinófilos en el modelo de pleuresía alérgica es probablemente debido a un deterioro de CCL11 / eotaxina y la producción de IL-5. Palabras clave: Myrtaceae, Syzygium cumini. Alergia, edema de la pata, pleuresía, citoquinas Myrtaceae es una familia de plantas ampliamente utilizado en la medicina popular en diferentes países y Eugenia y Syzygium son algunos de sus géneros más importantes. Las especies de esta familia a menudo se utilizan para diversos fines medicinales, incluyendo el tratamiento de la diarrea (1) y el dolor. Los datos experimentales también sugieren la acción de estas especies en los procesos inflamatorios, enfermedades respiratorias (2), y trastornos alérgicos (3). Las semillas de la Syzygium cumini (L.) Skeels (SC;. Myrtacea, Syn, Eugenia jambolana Lamk) se ha informado que son útiles como astringentes en la diarrea, así como la disentería (4). Otras partes de la planta se han reportado para poseer anti-diabética (5), bactericida (6) y anti-mutágenas (7) propiedades. El extracto de corteza de etanólica se ha informado que tienen actividad anti-inflamatoria en carragenano y edema formaldehído de la pata (2). El mismo extracto también ha demostrado inhibir la histamina, la serotonina (5-HT) - 2 y la prostaglandina inducida por el edema de almohadilla (8). El proceso alérgico tiene un importante componente inflamatoria en la que la activación de mastocitos y desgranulación son los primeros fenómenos observados. Durante este proceso, los mastocitos liberan varios mediadores inflamatorios, incluyendo histamina, 5-HT, plaquetas agregación de los factores (PAF), leucotrienos, y una variedad de citoquinas que pueden provocar muchos eventos asociados con la inflamación alérgica, tales como la formación de edema y la infiltración celular ( 9). la acumulación de eosinófilos es la característica principal de la inflamación alérgica, que son algunos de los leucocitos más abundantes presentes en el sitio. La activación y la regulación de la acumulación de eosinófilos en la inflamación alérgica dependen de la liberación de citocinas y quimiocinas, tales como interleucina-4 (IL-4), IL-5 y CCL11 / eotaxina en respuesta a un desafío antígeno (10,11). Una vez que alcanzan el sitio alérgica, eosinófilos desgranulan y liberan varios mediadores, incluyendo leucotrienos, proteína básica mayor, PAF, proteínas catiónicas, y neurotoxina derivada de eosinófilos que contribuyen al daño tisular extensa (12). La modulación de la acumulación de eosinófilos es uno de los objetivos principales para el descubrimiento de compuestos anti-alérgicas debido a su tejido potencial efectos perjudiciales. En el presente estudio, se investigó la capacidad de un extracto de hoja acuosa de SC para inhibir la formación de ratón alérgica edema y acumulación de eosinófilos en la pleuresía alérgica ratón y los mecanismos implicados en estos fenómenos Compuesto 48/80 (C48 / 80), ovoalbúmina (OVA, grado V), histamina, PAF, 5-HT, dexametasona, cromoglicato disódico, 3% PBS / leche, PBS, o - phtaldialdehyde, HBSS, adyuvante completo de Freund, y todos los demás reactivos más alta calidad se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). WEB2170 se obtuvo de Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Alemania), Percoll era de Amersham Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Suecia); May-Gruenwald-Giemsa, azul de toluidina y azul tripán se adquirieron de Merck (Río de Janeiro, RJ, Brasil). Hombre Swiss Webster (20-25 g) y ratones BALB / c (18-20 g) y ratas Wistar (180-200 g) de nuestra propia colonia (CECAL-Fiocruz) fueron alojados en una habitación con temperatura controlada y la iluminación, con el libre acceso a comida de laboratorio y agua del grifo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (13) y las directrices institucionales para el uso de animales (CEUA 00050/00). material vegetal y la preparación del extracto Se recogieron ramas enteras de Carolina del Sur, en Río de Janeiro en enero de 1999. El material vegetal fue identificado por el Dr. M. Graziela Barrozo (in memoriam), Jardín Botánico de Río de Janeiro, y un vale fue depositado en el Herbario del Jardín Botánico de Río de Janeiro con el número HB-83016. El extracto acuoso de hojas frescas de SC se obtuvo mediante decocción de las hojas en agua destilada (100 g / L) durante 3 a 5 min. El extracto se filtró, se liofilizó, se almacena a temperatura ambiente, y se disolvió en agua destilada inmediatamente antes del uso. caracterización HPLC del extracto La separación de los componentes de la mezcla era dependiente del pH de la fase móvil, con pH alrededor de 4 ser satisfactoria. Por lo tanto, se añadió ácido fosfórico al 0,1% a la fase móvil, para ajustar el pH a 4,1. La fase móvil se eluyó todos los compuestos fenólicos dentro de 30 min a 0,75 ml / min. El análisis se realizó sobre un Supelcosil LC 18 (250 mm x 4,6 mm, I. D. 5 m de tamaño de partícula) de la columna. Una muestra de 40,0 mg del extracto se pesó con precisión y se transfirió a un tubo de microcentrífuga 3,00 ml, suspendidas en 2,00 ml de metanol y se enfrió en un baño de hielo. La suspensión se sometió a ultrasonidos (Odontrobro Paulo, SP, Brasil) con una membrana Durapore (Millipore) con capacidad 0,5 ml. Se recogieron datos de HPLC y se procesan con un aparato de 6,12 modelo Shimadzu Clase-VP (Kyoto, Japón) equipado con un detector de red de diodos y software SP3 cromatográfico. El gradiente de elución de la fase móvil fue programado para el disolvente A (acetonitrilo: agua,, v v 5:95 /) y el disolvente B (acetonitrilo: agua,, v / v 90:10). La columna se equilibró previamente con la fase móvil (100% de disolvente A) durante 30 min a un caudal de 0,75 ml / min. La fase móvil se ajustó a pH 4,0 con ácido fosfórico. El caudal fue de 0,75 ml / min y el volumen de inyección 20 L. La temperatura de la columna se mantuvo a 25ºC durante el análisis. El programa de gradiente se inició con 0% de disolvente B y aumentó linealmente a 100% de disolvente B en 30 min o 3,33% / min. Las inyecciones se realizaron por triplicado. Después de 44 min, el programa de elución fue devuelto a la condición inicial y se mantuvo así durante 10 min con el fin de reacondicionar la columna. Ratones en ayunas durante la noche, recibió el agente antihistamínico, la H 1 antagonista de los receptores prometazina (10 mg / kg) o el extracto acuoso (25 a 100 mg / kg) por vía oral (po) en un volumen final de 200 L, 1 h antes de la estimulación. Los grupos de control se trataron de manera similar con vehículo solo. En algunos experimentos de pleuresía alérgica, la dexametasona se dio por vía intraperitoneal (2 mg / kg) 24 y 1 h antes de la estimulación (N = 7 / grupo). La inducción de edema de la pata edema de la pata se indujo como se ha descrito previamente (14). Brevemente, los ratones Swiss recibieron una inyección intraplantar (IPL) de C48 / 80 (100 ng / pata), histamina (100 L y la pata contralateral recibió el mismo volumen de solución salina estéril y sirvió como control (N = 7 / grupo). La volúmenes de cada pata trasera se midieron con un pletismógrafo (Ugo Basile, Varese, Italia) 30 min después de la estimulación. ratones Swiss sensibilización y edema de la pata alérgica se indujeron como se describe (15). Brevemente, los animales se sensibilizaron con una inyección subcutánea de 100 g / pata) y la inducción de edema de la pata se evaluó 30 minutos después de la estimulación (N = 7 / grupo). sensibilización activa de los ratones BALB / c se logró con una inyección subcutánea de emulsión de adyuvante completo de Freund (100 L). ratones sensibilizados desafiados con vehículo de solución salina sola se utilizaron como controles negativos. A las 24 h después del estímulo, los ratones se mataron con un exceso de dióxido de carbono y sus cavidades torácica se enjuagaron con 1 ml de PBS que contiene EDTA 10 mM, pH 7,4. El recuento total de leucocitos se hicieron con un contador automático Coulter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.). Diferencial de células se hicieron utilizando cytospin manchado (Shandon, Pittsburgh, PA, EE. UU.) mediante el método May-Gruenwald-Giemsa con microscopía de luz (100X). Los recuentos se informaron como números de células (x 10 6) por cavidad. ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas Los niveles de eotaxina e IL-5 en el líquido pleural libre de células se evaluaron mediante sándwich enzima ensayo de inmunoabsorción ligado usando pares de anticuerpos emparejados de Pharmingen (San Diego, CA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como picogramos por cavidad de dos experimentos por triplicado y los valores se obtuvieron por comparación con una curva estándar (0,015-15 ng / ml para la eotaxina e IL-5). la purificación de los mastocitos y la medición de la histamina Se aislaron mastocitos peritoneales de rata como se describe anteriormente (18). Brevemente, ratas Wistar macho (N = 7 / grupo) murieron con un exceso de dióxido de carbono y la cavidad peritoneal se lavó con 20 ml de heparinizada (10 UI / ml) libre de calcio y magnesio solución de Hank (HBSS -). Se recogió el fluido, se centrifugó a 150 g durante 10 min a 4ºC, las células sedimentadas se resuspendieron en HSSB - que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino y se sometió a un gradiente continuo de Percoll isotónico (72%) para el aislamiento de los mastocitos. mastocitos purificadas se volvieron a suspender en HSSB que contiene Ca2 + y Mg2 +. Pureza (95%) y viabilidad (98%) fueron evaluados por el azul de toluidina y azul tripán la exclusión de la tinción, respectivamente. Se añadieron las células a una placa de 24 pocillos (10 5 células / pocillo) y se preincubaron durante 1 h con 1 g / mL C48 / 80. La reacción se detuvo en hielo. La histamina se cuantificó en el sobrenadante mediante un ensayo fluorimétrico como se describió previamente (19). La intensidad de fluorescencia se midió a 450 nm (excitación a 360 nm) con un espectrofluorímetro Spectra Max Gemini EM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). El porcentaje de inhibición de la liberación de histamina se calculó como sigue:% de inhibición = 100 -. Los datos se presentan como medios de 0,05 fue considerado significativo. Caracterización química del extracto El rendimiento del extracto acuoso crudo fue de 6,5% sobre la base de las hojas frescas (hojas g / g). HPLC de huellas dactilares del extracto de hoja de SC acuosa mostró un diagrama de elución consistente con la presencia de taninos y flavonoides (Figura 1 A). Los picos se agruparon en tres regiones basándose en el perfil de absorción UV, y estas regiones mostraron los patrones típicos de absorción UV, apoyando la presencia de ellagitannin (Figura 1 B), galotanino (Figura 1 C) y flavonoides (Figura 1 D) en CAROLINA DEL SUR. La presencia de flavonoides también se observó por TLC usando NP / PEG (datos no mostrados). Efecto de la Syzygium cumini extracto sobre el edema de la pata provocado por compuesto 48/80 o ovoalbúmina Para evaluar el efecto del extracto de SC (extracto bruto obtenido a partir de hojas frescas por decocción en agua) en las reacciones alérgicas, que primero utilizó el modelo de edema anafilaxia causada por el desgranulador de mastocitos C48 / 80 o por OVA en animales sensibilizados. La administración ipl de C48 / 80 en la pata posterior del ratón desencadenó una significativa edema 30 min después de la inyección, como se muestra en la Figura 2 A. pre-tratamiento oral con el extracto de SC inhibió la formación de edema a dosis de 25, 50 y 100 mg / kg (inhibición máxima de 50% a 25 mg / kg) a casi el mismo grado que la prometazina, un compuesto anti-histamínicos (inhibición 65% a la dosis de 10 mg / kg; la Figura 2 a, recuadro). Es de destacar que el tratamiento oral con 200 o 400 mg / kg de extracto de SC inhibió la formación de edema en la misma intensidad (64 y 58%). La Figura 2 B muestra que OVA (50 po) fue capaz de inhibir el edema en un 50% (Figura 2 B, inserto). Efecto de la Syzygium cumini extracto sobre el edema de la pata provocado por diferentes mediadores de la inflamación La histamina, 5-HT y PAF son los principales mediadores de la inflamación que participan en la formación de edema alérgico. En un intento de entender el efecto de SC, se analizó el efecto del extracto contra el edema inducido por cada uno de estos mediadores. Como se observa en la Figura 3 A, inyección ipl de histamina (100 30 min) no se vio afectada por el pretratamiento oral con el extracto de SC a las dosis de 25, 50, o 100 mg / kg (Figura 3 C). Estos resultados sugieren que el efecto anti-edematogenic de extracto de SC oral sobre la hinchazón de la pata inducida por alérgenos se debió a un anti-histamina y efecto anti-serotonina. Efecto del extracto de Syzygium cumini sobre la liberación de histamina de los mastocitos peritoneales de rata degranulación de los mastocitos seguido de la liberación de vasodilatadores mediadores (histamina principalmente) es el principal componente de edema alérgico. En esta serie de experimentos se investigó el efecto del extracto de SC en la desgranulación de mastocitos a través de la liberación de histamina. Como se muestra en la Tabla 1. estimulación con C48 / 80 (5 g / ml, 1 h antes de C48 / 80) inhibió significativamente la liberación de histamina de los mastocitos (49,5%). Efecto de la Syzygium Cumini extracto sobre la pleuresía alérgica Veinticuatro horas después de la inyección intratorácica de OVA (12,5 0,001) en la cavidad pleural. Es importante tener en cuenta que esta inhibición fue selectiva, sin ningún efecto sobre el número de leucocitos totales, células mononucleares o neutrófilos. La inhibición de CCL11 / eotaxina y la producción de IL-5 por Syzygium cumini extracto Con el fin de comprender los efectos del extracto de SC en la movilización de eosinófilos durante una inflamación alérgica, se investigó el efecto in vivo de pre-tratamiento oral con SC en los niveles de CCL11 / eotaxina e IL-5 en el líquido de lavado pleural. Como se observa en la figura 5. la exposición al antígeno intratorácica aumentó significativamente los niveles de CCL11 / eotaxina e IL-5 en el lavado pleural de animales sensibilizados 24 h después de la estimulación (N = 7 / grupo; P 3.91 ng / mL CCL11 / eotaxina). Figura 1. HPLC huella digital del extracto de hoja de Syzygium cumini acuoso (l = 280 nm; A) que muestra los patrones típicos de elagitaninos (B), galotaninos (C), y flavonoides (D) en los espectros de absorción UV-visible. Figura 2. Efecto de pre-tratamiento por vía oral con diferentes dosis de extracto acuoso de Syzygium cumini (SC) sale sobre el edema de la pata inducido por el compuesto 48/80 (C48 / 80, 100 ng / pata; Panel A) o la ovoalbúmina (OVA, 3 0,05 en comparación con el control de solución salina (Student-Newman-Keuls post-test). Figura 3. Efecto de pre-tratamiento por vía oral con diferentes dosis de extracto acuoso de Syzygium cumini (SC) sale sobre el edema de la pata inducido por la histamina (100 0,05 comparado con el control (de Student-Newman-Keuls post-test). Figura 4. Inhibición de la pleuresía alérgica por pre-tratamiento oral (1 h) con el extracto acuoso de Syzygium cumini (SC) hojas (100 mg / kg). La pleuresía fue inducida en 14 ratones sensibilizados día por la exposición al antígeno (ovoalbúmina, OVA: 12,5 0,05 en comparación con el grupo no tratado (de Student-Newman-Keuls post-test). Figura 5. Efecto de pre-tratamiento oral (1 h) con el extracto acuoso de Syzygium cumini (SC) hojas (100 mg / kg) en la interleucina-5 (A) y CCL11 / eotaxina (B) generación de la ovoalbúmina (OVA) ratones estimuladas. Los niveles de proteína se determinaron por ELISA en lavados pleurales recuperaron 24 h después de la solución salina u OVA (12,5 0,05 en comparación con el grupo no tratado (de Student-Newman-Keuls post-test). Tabla 1. Efecto de la Syzygium cumini y extracto de cromoglicato disódico sobre la liberación de histamina de los mastocitos de rata peritoneal desafiados in vitro con el compuesto 48/80. Los resultados del presente estudio demuestran que el extracto de hoja de SC muestra una marcada propiedad anti-alérgica. El tratamiento con el extracto de SC inhibió el edema de la pata inducido por C48 / 80, un desgranulador mastocitos potente, en un grado comparable al efecto de prometazina, un clásico antihistamínico utilizado para aliviar los síntomas de las reacciones alérgicas. El tratamiento con el extracto de SC también inhibió el edema de la pata provocado por la exposición al antígeno, aunque este efecto sobre el edema de la pata alérgica no era equivalente al efecto observado sobre el edema inducido por 80 C48 /. Por otra parte, estos resultados indican un mecanismo diferente de la inhibición de C48 / 80 y edema de la pata inducido por antígeno por el extracto de SC, lo que sugiere una acción sobre objetivos específicos. La histamina, 5-HT y PAF se han informado ampliamente siendo los principales mediadores implicados en la formación de edema alérgico. El apoyo a estas observaciones, el tratamiento con SC muestra un efecto inhibidor sobre edema inducido por histamina y 5-HT, pero no pudo inhibir edema de la pata inducido por PAF. La participación de PAF en la formación de edema y la movilización de los eosinófilos en la inflamación alérgica se ha informado (20,21) y la falta de efecto del extracto SC sobre el edema inducido por PAF y la participación de los otros mediadores en la activación de edema de la pata alérgica puede cuenta para el efecto discreta del extracto de SC, el edema de la pata alérgica. Estos resultados sugieren que el extracto de SC puede ser mucho más eficaz en la inhibición de reacciones cuyo mecanismo depende de la liberación de histamina y de 5-HT. Kim y colaboradores (3) mostraron que el tratamiento con un extracto acuoso de S. aromaticum (L.) Merr. et Perry (Myrtaceae) capullos de las flores tenían un efecto inhibidor sobre la anafilaxia sistémica inducida-80 C48 / y la reacción de anafilaxia cutánea pasiva mediada por IgE. Estos resultados se deben a una acción inhibidora de este extracto en la liberación de histamina de los mastocitos. De acuerdo con este informe, se observó que el extracto SC también tuvo un efecto directo sobre la desgranulación de los mastocitos, la inhibición in vitro de la liberación de histamina inducida por C48 / 80. Este resultado sugiere que el efecto anti-edematogenic de SC en C48 / 80 o inducida por antígeno paw edema puede ser debido a una acción en el proceso de desgranulación de los mastocitos. Sin embargo, el efecto de extracto de hoja de SC en el edema provocado por la histamina exógena y la serotonina también sugiere que el extracto de SC tiene un efecto directo sobre la inhibición de estos mediadores. La presencia de polifenoles, ácido gálico, los derivados de ácido elágico (22,23), taninos (24, 25), y flavonoides glicosilados (23,26,27) se ha reportado en las especies de Syzygium. Hemos ampliado la observación anterior de que los extractos de hojas contienen flavonoides SC (23,27). Ramírez y Roa Jr. (28) mostraron una correlación entre la actividad anti-inflamatoria y el contenido de compuestos fenólicos totales en los extractos de SC. Nuestros resultados sobre el efecto anti-edematogenic del extracto SC también apoyan la observación anterior de desaceleración y sus colegas (29) que la presencia de glucósidos flavonoides pueden estar asociados con la actividad anti-inflamatoria de un extracto de metanol de E. jambos hojas. La presencia de compuestos fenólicos, especialmente los flavonoides, en el extracto acuoso de hojas de SC y su actividad anti-edematogenic justificar el uso de extractos acuosos e infusiones de la planta en la medicina popular. El tratamiento con el extracto de SC inhibe la acumulación de eosinófilos en la pleuresía alérgica, sin un cambio significativo en las células mononucleares o el reclutamiento de neutrófilos. Este tratamiento también inhibe el aumento de IL-5 y CCL11 / eotaxina niveles en el líquido de lavado pleural en pleuresía alérgica. Los eosinófilos juegan un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades alérgicas (30,31). La acumulación y la supervivencia de estas células están reguladas por IL-5 secretada por linfocitos T activados, así como por quimiocinas liberadas por el epitelio. Entre las quimioquinas C-C, CCL11 / eotaxina, un quimioatrayente de eosinófilos-específico, es uno de los mediadores más importantes de la inflamación alérgica, con un efecto potente y selectivo en la movilización de los eosinófilos de la médula ósea a la sangre (11,32-34). El efecto del tratamiento con el extracto de SC en los niveles de CCL11 / eotaxina IL-5 y puede explicar la inhibición específica de la acumulación de eosinófilos inducida por SC. Estas actividades del extracto SC probablemente pueden deberse a la presencia de flavonoides en el extracto, ya que estas sustancias aisladas de especies de Myrtaceae, incluyendo SC, son conocidos por ejercer una potente efecto inhibidor sobre una variedad de enzimas relacionados con la activación de las células y para la producción de mediadores inflamatorios (35,36). Algunos flavonoides aislados poseen (38) y analgésicos (39) actividades anti-inflamatoria (37), anti-alérgicas; Sin embargo, son pocos los flavonoides de las hojas SC (23,27) y las flores se han aislado o identificado (40). Nuestros resultados indican una actividad anti-alérgica del extracto SC observada por la inhibición de la formación de edema, la desgranulación de mastocitos y la liberación de histamina, así como la inhibición de la acumulación de eosinófilos y CCL11 / eotaxina y la producción de IL-5. Tomados en conjunto, los presentes resultados sugieren el potencial de SC como una terapia a base de hierbas para el tratamiento de enfermedades alérgicas. 1. Un Cáceres, Fletes L, L Aguilar, Ramírez O, L Figueroa, Taracena AM, et al. Las plantas utilizadas en Guatemala para el tratamiento de trastornos gastrointestinales. 3. Confirmación de la actividad contra las enterobacterias de 16 plantas. J Ethnopharmacol 1993; 38: 31-38. [] 2. 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Fax: + 55-21-2564-2559. E-mail: gracahenriques@fiocruz. br La investigación apoyada por el CNPq. F. A. Brito es el beneficiario de una beca de post-graduado de la CAPES. Recibido el 15 de junio de 2005. aceptamos 6 personas octubre, 2006. AV. Bandeirantes, 3900 14049-900 Ribeirão Preto SP Brasil Tel. / Fax: +55 16 3315-9120 bjournal@terra. br